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转载自科学网:新型冠状病毒结构解析

2020-04-15 阅读(17)

冠状病毒是在自然界中广泛存在的一类病毒,可引起包括呼吸道、消化道及神经系统在内的多系统疾病,高致病性冠状病毒感染已成为近10年来广受关注的公共卫生问题。201912月以来, 中国湖北省武汉市陆续发现了多例新型冠状病毒感染的肺炎患者,随着疫情的迅速蔓延,不到4个月的时间,全球确诊人数已超100万。世界卫生组织 (WHO) 将该新病毒命名为"Coronavirus Disease 2019,COVID-19",其病原已被确认为SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2), 该病毒是继SARS冠状病毒 (SARS-CoV) MERS冠状病毒之后又一种具有高传染性且可以引起重症呼吸道疾病的新型病毒。

 

1. 冠状病毒的结构

冠状病毒包含4种主要的结构蛋白:(1)非常大的(200 k) S糖蛋白,它形成在病毒包膜中发现的大体积(1520 nm)的聚体;(2)一种不寻常的M糖蛋白和内部磷酸化的N蛋白;(3)此外还有一个较小分子的跨膜蛋白E,一些冠状病毒还含有一个HE蛋白。30 kb正单链RNA基因组是已知的最大RNA病毒基因组。该类冠状病毒模式显示由S蛋白、N蛋白、M糖蛋白、E蛋白和RNA聚合链组成。决定病毒和细胞相互识别的是S蛋白的基因。

1 冠状病毒结构模式图

SARS-CoV-2SARS-CoVMERS-CoV同为单正链RNA病毒,可编码至少8种蛋白,除上述4种结构蛋白外,还包括4种非结构蛋白:3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶(3-chymotrypsin-like protease, 3CLpro)、木瓜蛋白酶样蛋白酶(papain-like protease,PLpro)、解旋酶(helicase)RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)

冠状病毒科(coronaviridae)根据病毒的血清学和基因组特点分为αβγδ 4个属,其中只有αβ属含有对人类具有致病性的毒株。SARS-CoV-2属于β冠状病毒B属(Sarbecovirus亚属),其RNA序列长度约30 kb,SARS-CoV-23CL水解酶的分子结构已经被中国科学家公布,3CL水解酶是病毒的一个关键蛋白质,病毒需要利用它来复制RNA。如果3CL水解酶的功能抑制,就可以阻断病毒复制。研究发现,SARS-CoV-2序列与在蝙蝠中发现的β-冠状病毒相似,其相似度为88%

 

2. 冠状病毒感染介导的炎症反应机制

 

致病性冠状病毒感染最初表现为轻微的流感样疾病,伴有发烧、呼吸困难和咳嗽等症状,进而发展为非典型间质性肺炎和弥漫性肺泡损伤。其中,重症患者多在发病1周后出现呼吸困难和/或低氧血症,病情严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍。SARS-CoV-2的致病机制目前尚未清楚,现有证据表明SARS-CoV-2主要通过急性的炎症反应导致严重肺部损伤,并导致细胞因子IL-1IFN-γIP-10MCP-1IL-4IL-10分泌增加,且患者感染后的细胞因子风暴强弱与疾病的严重程度相关。

SARS-CoV类似,SARS-CoV-2蛋白S可识别并结合宿主表面受体血管紧张素转移酶2(angiotensinconverting enzyme 2, ACE2), 使病毒吸附于细胞表面。ACE2是一种I型跨膜糖蛋白,在人体的肺部和消化道器官中表达量较高,是SARS-CoV进入细胞的重要受体。SARS-CoV S蛋白上的受体结合域(RBD)可与ACE2发生特异性结合,病毒感染由此开始。对SARS-CoV-2的结构解析研究发现,SARS-CoV-2 RBD中的394位氨基酸残基可被人ACE2上的关键赖氨酸识别;同时,尽管SARS-CoV-2 S蛋白与人ACE2的结合能力由于丢失的少数氢键有所下降,但仍然达到很强的结合自由能。对ACE2的阻断实验进一步验证了SARS-CoV-2SARS-CoV有着类似的感染行为,其入胞受体也被证实为ACE2

 

2 冠状病毒的感染和复制过程示意图

3. 可应用于新型冠状病毒检测的技术

 

新型冠状病毒目前临床尚无特效治疗药物,采取分区隔离、及时诊断,全面检测的策略是目前最为有效的方法。建立起快速检测确诊方法对新冠肺炎早发现、早防控、早治疗都极其重要。

 

3.1 荧光PCR检测技术

 

基于新冠病毒病原体的全基因序列,生物信息学分析出特征序列,根据PCR原理设计扩增上下游引物,以提取自病人样本RNA为模板,进行反转录聚合酶链反应(RT-PCR),利用高温变性打开双链、低温退火引物结合、适温目的基因延伸,30个左右反复循环即可得到指数级的数量增加,如可检测到大量DNA目的片段即可判定为阳性样品。新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)将实时荧光RT-PCR核酸检测技术作成疑似病例确诊检测金标准之一。

 

3 荧光PCR化学检测原理

荧光PCR在反应体系中加入了荧光化学物质,将PCR扩增与荧光信号的变化产生联系。常见的有荧光染料和探针染料两种。荧光染料可特异性与DNA双链可特异性与DNA双链小沟结合,产生数百倍增量的荧光信号;探针染料能与目的片段特异性杂交,5'端标记荧光基团,3'端标记猝灭基团,正常情况下两基团距离近,荧光基团因猝灭不发荧光,PCR扩增时,Taq酶切割探针,分离荧光基团发出荧光.结合专门仪器,可实现实时荧光检测,方便结果读取。

 

3.2 免疫检测方法

 

免疫检测利用抗原与抗体特异性结合的原理.新型冠状病毒表面存在多种结构蛋白,包括多个抗原表位,以此来制备抗体检测抗原的存在,可直接证明样本中含有新型冠状病毒;另一方法是测定人体内产生的抗体。病毒感染人体后,会刺激免疫细胞产生特异性抗体,主要为IgMIgG两类。免疫法快速检测一般采用试纸检测(1条红线阴性,2条红线阳性),大多数基于抗原抗体的胶体金原理。胶体金法检测IgM/IgG抗体原理基于免疫层析平台,滴加待测样品,如果样品含有IgM/IgG抗体,抗体与结合垫上的金标抗原结合,形成抗原抗体复合物,随后被检测线上的抗人IgM/IgG抗体捕获并显色。同时质控线上抗体与金标抗原特异结合而显色,以验证试纸正常。

4 胶体金免疫检测原理