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SARS-CoV-2受体蛋白ACE2研究进展

2021-04-09 阅读(76)

在过去的二十年中,三种冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV),中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2))引起了人类严重疾病的爆发。SARS-CoV-2导致持续的COVID-19大流行,对全球公共卫生构成了持续威胁,目前暂时没有特异性和有效的临床治疗方法。为了促进药物和疫苗的发展,迫切需要为研究SARS-COV-2的基础生物学和发病机制创造新的模型。最近,清华大学丁强团队在PLoS pathogens上发表了题为“Comparative analysis reveals the species-specific genetic determinants of ACE2  required for SARS-CoV-2 entry”的研究论文,该研究基于考拉、小鼠ACE2序列与人ACE2序列的比较结果,通过遗传和功能分析,发现了决定考拉和小鼠的ACE2不能有效结合SARS-CoV-2 S蛋白使其进入宿主细胞的关键位点。

病毒感染的第一步也是必不可少的一步是细胞受体识别。SARS-CoV-2通过结合血管紧张素转化酶2(ACE2)以物种依赖的方式进入宿主细胞。小鼠ACE2不能有效地结合SARS-CoV-2 S蛋白,阻碍了病毒进入小鼠细胞;因此,人们开发了人ACE2转基因和基因敲入小鼠来研究SARS-CoV-2的体内感染和发病机制。

 

研究结果:

1.通过分析不同ACE2直系同源物种S蛋白的RBD表面氨基酸残基,分析确定了考拉和小鼠ACE2中限制SARS-CoV-2进入的潜在物种特异性残基。其中一些关键残基在考拉和小鼠ACE2中有所不同:考拉中的T31和F83,小鼠中的F83和H353。这些取代可能破坏这些ACE2直系同源物与病毒的相互作用,从而破坏病毒的进入。

图1 ACE2中可能限制SARS-CoV-2进入的潜在残基

2.研究者观察了带有人源化氨基酸残基的突变小鼠和考拉结合S蛋白及介导病毒的能力:结果显示,S1-Fc与表达小鼠或考拉ACE2的A549细胞的结合非常低,与空载体转导的细胞中观察到的水平相当,而S1-Fc蛋白与表达人ACE2的A549细胞有效。结合人与小鼠hACE2 Y83F / K353H双突变体显著降低了结合率(49.9%vs 98.1%), 人与考拉的单个hACE2 K31T突变体具有显著受损的结合(52.8%vs 98.1%),随着残基353突变(K31T / K353H;28.6%vs 98.1%)而进一步降低,表明K31对ACE2与S蛋白相互作用至关重要;而双重人源化小鼠(mACE2 F83Y / H353)和考拉(kACE2 T31K / F83Y)突变体表现出更高的结合效率(83.9%和92.1%),尽管F83Y突变本身对小鼠或考拉ACE2与SARS-CoV-2 S蛋白的结合影响极小,但分别将此突变与H353K或T31K结合具有协同作用,以上结果表明小鼠ACE2中的残基353和考拉ACE2中的残基31是这两个直系同源物结合S蛋白的物种特异性限制的遗传基础。

图2 ACE2突变体结合病毒刺突蛋白

3.考拉和小鼠ACE2的遗传修饰使细胞易于感染SARS-CoV-2假病毒

为了进一步明确ACE2变体的异位表达具有功能性,且可以促进表达S蛋白的MLV逆转录病毒颗粒进入A549细胞,研究人员通过用不同的假病毒颗粒接种表达ACE2变体的A549细胞并进行培养后,裂解细胞并测定萤光素酶活性以确定假病毒颗粒是否成功进入。人ACE2(而非小鼠或考拉)的表达增强了SARS-CoV-2假颗粒的进入。这些数据与在SARS-CoV-2峰中观察到的这些ACE2蛋白的结合效率一致。与野生型同源基因相比,小鼠和考拉F83Y ACE2变体均未显着增加病毒进入。相反,mACE2 H353K和kACE2 T31K各自显着增强了病毒进入,并且在双重人源化突变体中维持了增加的进入。

图3 ACE2直系同源物及其人源化突变体介导SARS-CoV-2和SARS-CoV假病毒进入的能力

4. 考拉和小鼠ACE2直系同源物中限制性残基的人源化使细胞容易感染真正的SARS-CoV-2,研究人员还发现小鼠ACE2可以与SARS-CoV和SARS-CoV-2的S蛋白结合,并分别介导假颗粒的进入,但不与考拉结合。相比之下,人源化的考拉ACE2只能结合SARs-CoV-2的S蛋白,并仅介导表达该蛋白的假病毒颗粒的进入。这些观察结果突显了SARS-CoV和SARS-CoV-2通过ACE2进入所使用的不同机制。

5. 人源化小鼠ACE2可作为SARS-CoV-2受体在体内发挥作用。研究人员为了直接测试ACE2直系同源基因介导病毒感染过程中SARS-CoV-2进入的能力,在缺乏内源性ACE2表达且不易感染SARS-CoV-2的A549细胞中进行了基因互补实验。通过细胞内病毒核衣壳蛋白的免疫荧光染色,发现表达小鼠或考拉ACE2的A549细胞不易感染SARS-CoV-2,而表达人ACE2的细胞则易受感染,进一步确证了考拉(T31K)或小鼠(H353K)ACE2中的F83Y突变进一步可提高感染效率。同时,研究者利用腺病毒在小鼠体内表达人源化的小鼠(H353K)ACE2,该小鼠可以促进SARS-CoV-2的感染。

讨论

ACE2是确定SARS-CoV的-2感染的一个主要宿主因子。对易感性(人类)或非易感性(树袋熊和小鼠)直系同源物的序列和病毒受体活性的比较分析,为了解ACE2如何介导SARS-CoV-2进入并定义ACE2的物种特异性遗传决定因素提供了更多的思路。