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向治愈进发——乙肝病毒感染治疗策略

2019-10-28 阅读(53)

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染在全球范围内是导致肝脏疾病的常见原因,在东南亚地区疾病负担尤其严重。根据世界卫生组织(WHO)估计,全球有大约2.57亿HBV感染患者。目前,疫苗、核苷或核苷酸(NUC)类药物不但能够降低新感染率,而且对于坚持长期病毒抑制疗法的HBV患者来说,能够延缓肝病的进展。然而科学和医学界并不满足于现状,他们已经开始共同努力,开发旨在治愈这一感染的创新抗病毒药物和免疫学疗法。近日自然回顾药物上的一篇综述对目前治疗HBV感染的研发策略进行了全面的盘点。

 

功能性治愈HBV感染面对的挑战

共价闭合环状DNA  (cccDNA)
HBV能够在被感染细胞的细胞核中生成cccDNA和整合序列。这些序列是
病毒蛋白的转录模板。cccDNA是生成前基因组RNA(pgRNA)的模板。pgRNA提供了逆转录和病毒基因组复制所需的模板。
cccDNA是一个病毒微型染色体,它是导致病毒在受到感染的细胞中长期存在的原因。它的半衰期非常长,目前的标准疗法不能有效清除cccDNA。

cccDNA的表观遗传学调控

HBV的特殊免疫特征

HBV具有的一些重要免疫学特征让它们能够长期存在并且不易清除。HBV在肝细胞内的复制不会被细胞内的先天免疫系统察觉。HBV能够生成和分泌大量病毒抗原,逐渐改变和耗竭HBV特异性T细胞和B细胞的功能。即便使用目前的标准疗法,免疫反应的缺陷导致患者很难将HBV特异性免疫力恢复到正常水平,因而无法有效控制感染。

 

HBV的生命周期和创新治疗手段

HBV的基因组是长为3.2kb的松弛环状DNA(rcDNA)基因组。它与聚合酶一起包装在病毒衣壳中,外面覆盖着包膜蛋白(HBsAgs)。HBV的生命周期可以分为以下几步:

HBV通过与肝细胞表面的NTCP受体相结合进入细胞,而后,病毒脱去包膜蛋白,衣壳进入细胞核,释放环状DNA。宿主的DNA修复机制会将这些外源DNA转换成cccDNA。它们与宿主的组蛋白和其它蛋白一起包装成微型染色体。这种微型染色体是肝细胞核中长期存在的病毒基因组储备库,它的数量可以通过感染新肝细胞和细胞间核衣壳的回收而不断增加。

cccDNA是生成pgRNA的模板,它需要肝炎X蛋白(HBx)才能维持正常表达。cccDNA转录生成6种RNA,其中包括与HBV聚合酶结合的pgRNA。与pgRNA 结合的聚合酶通过与核蛋白和P蛋白构成的6聚体结合,启动核衣壳的组装。prgRNA在未成熟的核衣壳内引导松弛环状DNA的合成,生成成熟的核衣壳。成熟核衣壳如果与HBsAg相结合,会引发病毒获得包膜蛋白,并且被释放到细胞外。

HBV的生命周期

 

目前,多种创新疗法可以靶向HBV生命周期中的这些步骤,达到降低病毒负荷的目的。

 

 

 

防止HBV进入细胞

病毒的不断复制和释放会导致新的肝细胞被感染,从而维持慢性感染和cccDNA库的稳定。在大多数患者中,NUC疗法无法完全抑制病毒产生。因此,将病毒进入抑制剂与复制抑制剂联用是减少cccDNA库的有力手段。
防止病毒进入细胞的方法包括开发从HBsAg中衍生的多肽。它可以通过与NTCP受体结合,阻碍HBV病毒进入细胞。例如Myrcludex B(又名bulevirtide),这款多肽作为单药疗法,能够在48周之后,将HDV的RNA水平降低2.84 log。它与干扰素联用的效果更好。
除了多肽以外,小分子药物(例如ezetimibe和环孢素衍生物)和靶向HBsAg的
单克隆抗体也在研究中被用于阻断HBV进入细胞。


直接靶向cccDNA
抑制cccDNA的生成是一个有吸引力的策略。然而,我们需要对cccDNA合成的过程具备更全面的了解,才能靶向这一过程。因为cccDNA生成过程中的很多关键步骤需要宿主细胞核中的蛋白酶,微型染色体的形成也需要宿主的组蛋白和其它蛋白。抑制cccDNA生成的疗法可能会靶向宿主蛋白,它们可能比靶向
病毒蛋白的疗法具有更多的毒副作用。
锌指核酸酶(zinc-finger nucleases)可以被用来直接靶向cccDNA,这一策略在细胞培养模型中已经能够成功编辑HBV的cccDNA。
基于CRISPR-Cas9的治疗方法可以在cccDNA中加入突变或者缺失,导致cccDNA失活。临床前研究表明,超过90%的HBV DNA可以被Cas9切割。然而,大约7%的cccDNA基因组在经过CRISPR-Cas9介导的切割之后,能够被修复成不影响cccDNA功能的状态。因此,这一策略需要引入靶向cccDNA中不同位点的多个指导RNA(gRNA),确保cccDNA的失活。

基因编辑疗法的继续开发需要解决肝细胞递送、脱靶效应等挑战,然而,目前这是唯一一种在组织中让cccDNA永久性失活的方法。
靶向病毒基因表达。高病毒抗原负荷被认为在维持慢性感染中起到重要作用,因此,通过沉默cccDNA的转录或者降解病毒RNA来降低病毒抗原的表达水平也获得研究人员的关注。
基于核苷酸的抗HBV疗法使用RNA干扰或反义寡核苷酸(ASO)来降低HBV mRNA的水平。业界的普遍观点是靶向HBV mRNA是治愈性疗法的重要组成部分。它可以限制HBsAg的表达,从而帮助HBV特异性免疫力的恢复。这一技术平台的另一个特点是可以通过对靶点序列的筛选,设计出同时靶向多种HBV mRNA的疗法。

 

 

RNAi疗法靶向病毒mRNA的示意图

 

Arrowhead公司开发的RNAi疗法ARC-520在临床试验中的表现展现了这类疗法的潜力。如今的第二代HBV RNAi疗法已经在临床试验中表现出可喜的疗效。例如JNJ3989ARO-HBV)能够将HBsAg蛋白水平平均降低1.7-2.0 log

 

靶向衣壳组装步骤
将衣壳组装抑制剂与NUC联用可能进一步降低病毒水平,从而在慢性乙肝患者中提高HBV特异性免疫反应的恢复。目前抑制衣壳组装的小分子药物可以分为两类:核蛋白异构调节剂(CpAMs)可以导致非衣壳核蛋白多聚体的组装错误(例如GLS4RO7049389);衣壳组装调节剂可以让衣壳正常组装,但是不包含病毒核苷酸(例如AT-130 NVR-3778 JNJ6379等)。这两类抑制剂不但可以减少病毒颗粒的释放,而且可以阻断核衣壳向细胞核的运输,从而降低cccDNA的形成。

在短期临床试验中(小于12个月),衣壳组装抑制剂能够降低HBVDNARNA水平。例如,在施药期结束之后,NVR-3778能够让HBVDNA水平降低1.72 logJNJ6379的表现为2.16-2.89 log
靶向HBsAg的释放
核酸聚合物(由于其两性聚合物)的特性,可以产生抗病毒作用。它们对HBV感染的特殊作用在于能够抑制受到感染的肝细胞释放HBsAg。近来的临床试验表明,Replicor公司开发的
REP2139(一种核酸聚合物),和富马酸替诺福韦二吡呋酯(TDF)和聚乙二醇化干扰素α2apeg-IFN)联用,能够达到对80%HBV感染患者的功能性控制

 

免疫调节疗法

协同激活人体的抗病毒免疫力可能导致HBV的功能性治愈。HBV受到控制的患者表现出协调的HBV特异性激素和细胞免疫反应。他们针对不同的病毒抗原产生强劲的T细胞反应,并且B细胞能够分泌抗HBV抗体。因此,激活免疫机制让人体自发清除HBV感染,可能成为治疗慢性HBV感染的一种治疗手段。
靶向先天免疫力的治疗策略
靶向先天免疫力的疗法主要利用细胞因子(TNFIFNαIFNγIL-1β)的抗病毒效应,它们同时能够诱发适应性免疫力。IFNα就是基于这一原理。IFNα疗法能够在5-10%的慢性乙肝患者中达到功能性治愈。这一疗法的作用机理在于IFNα不但具有直接抗病毒效果,而且可以提高自然杀伤(NK)细胞的反应。而且,接受IFNα治疗后达到HBsAg阴性的患者恢复了HBV特异性T细胞反应。
抗病毒细胞因子还有可能清除cccDNA,这是治愈慢性乙肝患者最直接和有效的方法。体外研究表明,IFNα或淋巴毒素可能诱发对病毒DNAAPOBEC依赖性脱氨基作用。这可能降低受到感染的肝细胞中的cccDNA水平。
在慢性乙肝患者中激活先天免疫力还可以通过Toll样受体(TLR)或RIG-I激动剂来实现。RIG-I激动剂能够在肝细胞中直接激活先天免疫力,而TLR7TLR8激动剂能够激活肝细胞周围的免疫细胞。名为inarigivirRIG-I激动剂同时具有直接抗病毒效应。在临床试验中,它能够剂量依赖性降低HBVDNARNA水平,而且26%的患者HBsAg水平出现下降。
TLR7激动剂GS-9620能够在浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells)中激活IFNα的生成。TLR8激动剂能够强力激活肝内单核细胞和树突状细胞生成和分泌IL-12IL-18。而IL-12IL-18会激发IFNα的生成,而且IL-12可以部分恢复耗竭HBV特异性T细胞的活性。

靶向适应性免疫力的策略
HBV特异性免疫反应在慢性乙肝患者中出现缺陷。理论上这一缺陷可以通过免疫检查点抑制剂(例如抗PD-1或抗CTLA-4疗法)或治疗性疫苗来解决。抗PD-1疗法在慢性乙肝患者中显示出一致但是有限的抗病毒活性,然而研究人员仍然需要确定筛选患者的标准和抗PD-1疗法的最佳剂量。治疗性疫苗目前尚未取得显著疗效。
这些免疫疗法疗效不佳的原因可能与慢性乙肝患者的抗HBV免疫反应相关。在慢性患者中,HBV特异性T细胞非常稀少,而且显示出耗竭表型。而且,阻断PD-1信号通路可能要与其它细胞因子疗法联用才能够让HBV特异性B细胞恢复活性。
利用基因工程,生成靶向HBVTCR-T细胞疗法或者CAR-T疗法可以帮助克服这一障碍。这类疗法在体外和动物试验中能够识别HBV感染的靶标。然而,因为制造T细胞疗法的过程非常复杂,这限制了临床试验的进展。

业界逐渐达成的共识是:我们需要具有创新作用机制的组合疗法才能达到功能性治愈的目标。这些疗法需要达到以下目标:完全抑制病毒生产和从头感染;完全抑制HBsAg的产生;适当激活免疫系统,提高HBV特异性适应性免疫反应;在肝脏中安全控制免疫反应的强度
在设计检验组合疗法的临床试验时,我们需要具有坚实的科学基础,在临床前阶段了解不同疗法的潜在重叠毒副作用,从而在临床试验中及时评估负面反应和潜在药物相互作用。

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