卡梅德生物科技(天津)有限公司
服务电话：022-82164980
地址：天津市武清区创业总部基地B15-502
邮箱：info@kmdbioscience.com
卡梅德生物科技（KMD BioscienceTM）能够为客户提供高质量的，基于M13噬菌体展示的驼源抗体筛选服务，包括双峰驼和单峰驼（羊驼）来源的纳米抗体噬菌体展示技术服务。我们的科学家拥有多年的重链抗体（Vhh抗体）文库展示构建，筛选经验，能够在较短的时间周期内获得高品质的纳米抗体。
驼源抗体文库制备-重链抗体背景
传统意义上血清抗体主要包括IgG1，IgG2，IgG3和IgG4 四种亚型,而驼源主要血清抗体包括IgG1，IgG2和IgG3三种类型，其中IgG1与传统抗体结构相似，含有2条重链和2条轻链；IgG2和IgG3缺少CH1和轻链结构域，因此也被称为重链抗体(heavy Chain Antibody, hcAb)，如图1所示：
图1 经典抗体与重链抗体模式结构
(a) 传统抗体 及其Fab/scFv抗体形式 (b) 重链抗体及其VHH抗体形式
重链抗体在羊驼和骆驼血清中的分步是不均衡的，骆驼血清抗体中重链抗体占比约为60-75%，羊驼血清抗体中重链抗体占比约为40-50%。这这种显著的差异导致了构建的骆驼VHH抗体文库具有先天的优势，如表1所示。驼源抗体文库主要是指利用驼源重链抗体的可变区，即VHH区域序列构建的VHH抗体文库，又叫纳米抗体文库。VHH抗体的特点是只含有重链抗体的抗原结合区，如图2所示，氨基酸长度约为110AA，SDS-PAGE显示分子量约为15kDa（远小于传统抗体150kDa的分子量），具有优秀的稳定性，能够抵抗极端的pH环境。 同时在VHH人源化改造方面，也具有良好的适应性，容易满足Car-T等免疫细胞的改造和分选实验要求。
图2 羊驼重链抗体与VHH抗体模式
骆驼与羊驼VHH抗体文库对比
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比较项目 |
骆驼VHH抗体文库 |
羊驼VHH抗体文库 |
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抗原耐受量 |
高，多种抗原混合，高剂量免疫 |
较高，多种抗原混合中等免疫剂量 |
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抗血清滴度 |
高 |
高 |
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中和抗体效价 |
高 |
较高 |
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抗体亲和力 |
更容易获得高亲和力抗体 |
能够获得高亲和力抗体 |
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抗原需求量 |
4-6mg，纯度>85% |
2-3mg，纯度>85% |
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采血量 |
一次可采血100ml |
一次20ml血液 |
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PBMC细胞量 |
高 |
一般 |
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有效库容 |
高，免疫库108-109 |
高，免疫库107-108 |
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免疫代价 |
较低 |
高 |
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小分子抗原反应性 |
高 |
一般 |
驼源抗体文库制备-骆驼VHH抗体库构建服务
卡梅德生物科技(KMD BioscienceTM)能够为客户提供高质量的、骆驼来源的VHH抗体噬菌体展示文库制备服务。我们坚持采用人用疫苗和生物制药的QbD（Quality by Design）设计原则，在充分理解和尊重ICH原则的基础上，设计并制备骆驼VHH抗体噬菌体展示文库，为客户提供全程可追溯的产品追溯体系和文件支撑体系。一个优秀的VHH抗体噬菌体展示文库包含抗原设计，动物免疫，文库构建与筛选等主要环节。
---VHH抗体噬菌体展示文库之抗原设计
针对骆驼VHH抗体文库，我们设计了一系列来自于驼源抗体Fc融合表达的人源免疫检查点蛋白。结合我们成熟的Freestyle 293F和Expi CHO细胞悬浮表达平台，我们能够为客户在较短的周期内从基因合成，载体构建到克级蛋白的表达，更多的服务需求，请咨询我们的蛋白表达平台。同时，根据我们的实验结果，我们发现小分子靶蛋白直接与人源Fc片段融合后免疫效果要远远好于靶蛋白融合羊驼或骆驼Fc片段后免疫结果（具体实验结果，请联系我们的技术人员）。
---VHH抗体噬菌体展示文库之动物免疫
卡梅德生物科技(KMD BioscienceTM)通过与骆驼和羊驼养殖社建立合作，提供未经免疫的，足龄（28-36月龄）的骆驼或羊驼进行抗原免疫，按照标准免疫方法，免疫4-7针。蛋白抗原按照ELISA血清效价>105标准；小分子抗原免疫ELISA血清效价>104标准。
---VHH抗体噬菌体展示文库之文库构建与筛选
卡梅德生物科技(KMD BioscienceTM)采用M13噬菌体的pIII蛋白进行VHH抗体(纳米抗体)表面展示。我们的科学家构建了带有Flag和6*His tag双标签的噬菌体载体，同时制备出了具有108转染效率的TG1和XL1-Blue宿主菌感受态，经过2-3次转染与扩增，能够为客户提供有效库容量为108-109,且包装库容为1013-1016/ml颗粒数的高质量VHH抗体展示文库。通过抗原极限施压筛选方式，经过3轮纳米抗体文库淘筛，即可获得多达20-30株具有高亲和力的噬菌体株。通过简单的IPTG诱导，即可在1-2周内获得大量抗体表达产物，以满足客户FACS，细胞活性测试等研究需求。
驼源抗体文库制备---项目流程
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步骤 |
服务内容 |
周期 |
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Step1：动物免疫 |
1. 准备1只健康、足龄双峰驼(28-36月龄)
2. 免疫骆驼4-7次
3. ELISA检测血清效价，效价满足要求后取外周血；若效价不满足要求，则终止试验 |
6-8周 |
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Step2：抗体cDNA制备（客户可以直接提供细胞，从此步开始） |
1. 总RNA提取
2. 高保真RT-PCR制备cDNA |
3-4周 |
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Step3：构建抗体库 |
1. 引物设计与合成：抗体可变区兼并引物设计、合成
2. 以cDNA为模板，PCR扩增重链抗体基因可变区
3. 噬粒构建与转化：酶切、连接噬菌粒载体，电击转化TG1宿主菌，构建抗体库
4. 鉴定：随机挑选96个克隆，PCR鉴定阳性率
5. 包装，＞1⨯1013 /ml噬菌体颗粒 |
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Step4: 文库淘筛
(3轮) |
1. 抗原极限施压法进行3轮淘筛
2. 鉴定：随机挑选96个克隆，ELISA效价测定
3. 多达96个阳性克隆进行基因测序，挑选最优的10-15个克隆进行原核表达转化
4. 10-15个阳性克隆表达制备VHH抗体上清 |
3-4周 |
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交付 |
1. 构建与筛选报告，包括测序报告，图片数据；
2. VHH抗体文库2ml，＞1⨯1013 /ml噬菌体颗粒
3. 10-15个阳性克隆表达制备VHH抗体上清
4. 10-15个阳性克隆表达菌种 |
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注：1.客户提供骆驼外周血淋巴细胞，淋巴结细胞或脾脏细胞（保存在RNA later等溶液中，避免ＲＮＡ降解，蓝冰运输），从第二步开始制备VHH抗体文库，只需3-4周即可完成。
2. 采用TriZol溶液制备细胞裂解物，干冰运输。
驼源抗体文库制备----服务优势
---同时提供免疫库制备服务和天然骆驼/羊驼抗体文库筛选服务
---周期短，约16-20周即可获得高质量的文库和单抗细胞株
---高库容量：有效库容 108 – 109/免疫库；109 – 1011/天然库
---高亲和力抗体制备
---个性化的淘筛策略
---完整的文件追溯体系和QC质控文件
驼源抗体文库制备----实验流程
如何订购？
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