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人源scFV抗体库构建服务

卡梅德生物科技能够为客户提供基于抗体噬菌体展示文库技术的single-chain Fv(scFv)抗体文库构建服务。

 

抗体文库制备服务 – 人源scFV抗体库构建服务

噬菌体展示抗体文库被广泛应用于高亲和力抗体的筛选工作,如血管生成标志物纤连蛋白,肿瘤特异性B3/B4抗原,EGFR等蛋白特异性高亲和力抗体的筛选。通过噬菌体展示技术构建的抗体文库通常来源于RT-PCR扩增外周血单核细胞,脾细胞,骨髓细胞和扁桃体来源的mRNAs形成cDNA片段,将这些基因片段拼接到噬粒载体,再转入噬菌体形成共价结构蛋白表达和体外展示。抗体重链和轻链完全独立自由表达,然后随机地组合,形成噬菌体克隆数达到1011-1012的庞大抗体库。

Single-chain Fv(scFv)抗体文库是指将抗体的可变区(VH和VL)基因,尤其是CDR区域(互补决定区)采用不同的策略和方式,如氨基酸突变,移码读框等形成数目庞大的不同克隆,并从这些克隆中筛选出针对目的抗原的高亲和力单链Fv抗体。大量的研究表明,抗体可变区的CDR3的多样性直接决定了抗原特异性和结合亲和力,并且CDR3-FR(frame region)组合的多样性决定了抗体经历何种方式的亲和成熟过程。我们的科学家具有丰富的抗体文库构建经验,采用错误倾向性PCR,巢式PCR等技术构建达到108-109CFU库容量的一级文库。相比Fab 抗体文库,由于scFv抗体分子量更小,约25kDa,scFV抗体更加稳定,也不容易形成多聚体。

 

噬菌体宿主体系

卡梅德生物科技噬菌体展示平台拥有M13,T4和T7噬菌体系列,根据客户的项目需求(展示的蛋白或抗体片段的大小等参数),我们会采用不同的噬菌体系列进行文库构建。在我们完成的案例中,基于M13噬菌体pIII基因展示体系较为常用,构建的库容量可以达到1011,其中有效库容量为109

同时,客户也可以提供抗原,我们进行体外外周血淋巴单核细胞敏化,从而获得更高亲和力和特异性的单克隆抗体,通常基于该方法制备的抗体亲和力能达到10-13 M级别。

 

项目流程: 

步骤

服务内容

周期

抗体cDNA制备

1. RNA提取

2. 高保真RT-PCR制备cDNA

3. 系统对照:Actin特异引物PCR扩增,以鉴定逆转录产品cDNA质量

8-9

构建抗体库

1. 引物设计与合成:抗体可变区兼并引物设计、合成

2. cDNA为模板,PCR扩增抗体重链和轻链可变区基因

3. scFv基因拼接

4. 噬粒构建与转化:酶切、连接scFv和噬菌粒载体,电击转化TG1宿主菌,构建抗体库

5. 鉴定:随机挑选20-50个克隆,PCR鉴定阳性率,测序和分析抗体序列

6. 包装,>1*1013噬菌体颗粒/ml

交付

*构建报告,包括详细建程序,代表性序列信息。

*产品交付:细菌和噬菌体两种形式抗体库。