1.VHH抗体概念

VHH抗体，即纳米抗体（Nanobody, Nbs）是驼科动物外周血清产生的一种单链抗体，这些抗体仅由重链组成，缺乏轻链和功能性CH1和CH4结构域。VHH晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15KDa。相较于传统抗体，纳米抗体因其分子量小，从而更容易可穿透血脑屏障；原核或真核系统有高表达量；特异性强，亲和力高；对人的免疫原性弱等优点，因此在抗肿瘤药物研发、心脑血管疾病、免疫疾病等领域有巨大价值。

2.什么是Alfa tag

专门的表位标签广泛用于检测、操作或纯化蛋白质，但它们的多功能性通常是有限的。ALFA 标签，这是一种合理设计的表位标签，在生命科学中具有非常广泛的应用，同时优于 HA-、FLAG- 或 myc-标签等已建立的标签。

ALFA 标签，它的15个氨基酸序列是亲水性的，在生理 pH 值下不带电荷，并且没有胺反应性固定剂或交联剂靶向的残基。它极有可能形成稳定的 α-螺旋，即使在苛刻的化学处理后也会自发地重新折叠。由于其紧凑的结构，标签在物理上比大多数线性表位标签小。ALFA 标签与蛋白质功能兼容，可以放置在 POI 的 N 端或 C 端，甚至可以放置在两个单独折叠的结构域之间。

图1：最小的ALFA 标签的序列

3.Alfa tag VHH抗体

为了开发结合 ALFA 标签的纳米抗体（NbALFA），我们免疫羊驼并通过内部开发的纳米抗体选择方法选择特异性靶向 ALFA 标签蛋白的纳米抗体。最好的结合剂用异位半胱氨酸进行基因改造，允许进行位点特异性固定或荧光团附着。

4.NbALFA 的晶体结构

为了更好地理解 NbALFA 和 ALFA 标签之间的相互作用，解析了与 ALFA 肽复合的 NbALFA 的晶体结构. NbALFA 采用典型的 IgG 折叠，包含两个通过二硫键连接的 β-折叠。接受 ALFA 肽的互补位从纳米抗体的 N 端帽延伸到由五链 β 折叠形成的一侧。它主要由互补决定区 (CDRs) 2 和 3 构成，还涉及形成疏水腔的五链 β 折叠内的残基。因此，ALFA 肽的方向平行于 NbALFA 的中心轴。ALFA 肽形成一个长度约为 2 nm、直径约为 1.3 nm 的 α 螺旋柱体，它通过分子内相互作用的复杂网络稳定。此外，该肽与 NbALFA 形成多重极性和疏水性接触。

图2：NbALFA 的晶体结构

5.Alfa tag VHH抗体应用

5.1通过免疫荧光检测 ALFA 标记的蛋白质

在 PFA 固定哺乳动物细胞的免疫荧光 (IF) 应用中，荧光标记的 NbALFA 特异性识别在蛋白质内不同位置携带 ALFA 标签的靶蛋白。重要的是，所有测试的蛋白质都显示出它们的特征定位（Tom70-EGFP-ALFA：线粒体外膜；ALFA-波形蛋白：丝状结构；EGFP-ALFA-TM：质膜），因此 ALFA 标签与标记蛋白折叠和正确定位兼容。在定量测定中，在任一末端携带 ALFA 标签的 EGFP 的核质分布与未标记的 EGFP 无法区分。未观察到与细胞膜或细胞器的非典型相互作用。因此，我们得出结论，ALFA 标签似乎不会损害标记 POI 的生理行为。

图3：通过免疫荧光检测 ALFA 标记的蛋白质

5.2在体内检测和操纵ALFA 标记的蛋白质

纳米抗体在哺乳动物细胞内具有可用于检测或操纵活细胞中的靶蛋白的功能。事实上，当在哺乳动物细胞中共表达 ALFA 标记的目标蛋白和与 mScarlet-I 28 融合的 NbALFA 时，NbALFA-mScarlet-I 与 ALFA 标记的目标蛋白稳健地共定位，具有最小的脱靶信号，从而清晰地检测到ALFA 标记的结构。这证明了 NbALFA 在活细胞中具有结合 ALFA 标签蛋白的能力。此功能非常适合与 CRISPR-Cas等基因组编辑工具结合使用，并允许在体内以内源水平操作 ALFA 标记的蛋白质。

图4：NbALFA检测ALFA 标签蛋白

5.3免疫印迹

在蛋白质印迹应用中测试ALFA 系统，并且可以使用标有 IRDye800CW 的 NbALFA 特异性检测来自转染细胞的裂解物中的 ALFA 标记的波形蛋白。为了比较 ALFA 系统与常见表位标签的性能，我们使用了包含 HA-、myc-、FLAG- 和 ALFA-标签的融合蛋白。在相同浓度的一抗或纳米抗体下，获得的 ALFA 标签信号比所有其他表位标签获得的信号强 3-10 倍。在没有进一步优化的情况下，NbALFA 产生了至少三个数量级的显着线性信号并且能够检测低至100pg 的目标蛋白。因此，与所有其他表位标签相比，检测限高约10倍。

图5：通过荧光蛋白质印迹法检测 ALFA 标记的目标蛋白

6.卡梅德生物提供纳米抗体制备服务

相比较传统的单克隆抗体，纳米抗体的制备具有很大优势。可以概括为免疫羊驼获得抗体基因和噬菌体展示来获得目的抗体序列。主要分为羊驼免疫，噬菌体文库构建，筛选抗体库、抗体表达与功能验证四个步骤。

6.2.1羊驼免疫

挑选适龄羊驼→准备抗原→免疫羊驼→采血测定效价→PBMC细胞分离

6.2.2 噬菌体文库构建

RNA提取→cDNA反转录合成→PCR扩增→连接载体并电转化→细菌文库/噬菌体文库建立

6.2.3抗体库筛选

常规使用的筛选方法是固相筛选，磁珠和细胞筛选，卡梅德生物可以根据客户需求提供定制化的筛选体系。

6.2.4抗体表达与功能验证

构建哺乳表达载体进行表达→过镍柱纯化→亲和力测定

图6：Fc-VHH纳米抗体表达结果图片

为了结合 ALFA 标签，我们开发了纳米抗体，因为它们体积小、单价且坚固，可以很容易地通过遗传手段进行修改，并在各种生物体中重组产生。 因此，它们可以用荧光团或寡核苷酸进行位点特异性固定或定量修饰。 因此，与传统抗体相比，纳米抗体在传统和先进的显微镜检查中更胜一筹，因为它们可以在拥挤的区域找到更多的目标表位，将荧光团定位在更靠近目标蛋白的位置，并避免 POI 聚集。 有趣的是，NbALFA 甚至在真核细胞内折叠，因此可以用作体内检测或操纵 ALFA 标记蛋白的胞内抗体。