1. 我想要提高反转录效率，能不能通过延长反转录时间来实现呢？

答：

在反转录实验中，一般情况下，延长时间是不会对反转录效率有显著提升的；但对于具有高GC含量（如GC含量≥60%）或有部分二级结构的RNA模板，适当的延长反转录时间可能会有一定的帮助。

2. 判定RNA质量好坏的依据有哪些呢？

答：

（1）RNA的纯度，通过使用紫外微量分光光度计对RNA的纯度、浓度进行检测分析，纯度的评定标准则是根据OD260/280和OD260/230两个比值来决定的，不同的OD值检测出来的数据是不一样的，检测杂质的OD值在230，检测核酸的OD值在260，检测蛋白质的OD值在280；纯净的RNA的OD260/OD280在1.8-2.4之间，OD260/OD230在1.5-2.4之间，若有蛋白残留或有机物污染都会使比值降低。（2）RNA的完整度：对RNA的完整度进行检测鉴定的最直接的方法就是琼脂糖凝胶电泳。

3. 我要做反转录PCR，我应该如何选择反转录的引物呢？

答：

常用的引物有三种：（1）随机引物(Random Primer)（2）Oligo d(T)（3）基因特异性引物(GSP)。引物要根据实验的不同目的进行选择，如我们反转录是为了后进行后续qPCR的话，将RNA反转成cDNA要选择能避免避免3’端和5’端的合成偏好性的引物，一般情况下会选择Oligo d(T)和随机引物的混合物，这样可以在一定程度上避免造成实验的误差。

4. 进行RT-PCR反应后，进行PCR产率很低是什么原因呢？

答：

很大可能是因为cDNA扩增效率低，可以通过对比PCR反应体系中加入不同浓度的cDNA模板的扩增结果，结果验证时，若出现不是很清晰但又可以看出来的非特异性条带，则说明加入的cDNA模板过量，需要对模板进行稀释，根据预实验的结果摸索合适的cDNA浓度。

5. RT-PCR的引物设计有什么要求？

答：

RT-PCR的引物设计要求与PCR 的引物设计要求一致，首先，引物的长度最好在15-30bp之间，过长过短都不利于实验结果，引物中的四种碱基最好占的比例差不多且要避免嘌呤和嘧啶的聚集；引物序列中不应该含有有二级结构，防止有发卡结构和自身折叠的出现。引物的3’端序列要与模板的序列严格互补，不能存在修饰，5’末端碱基可以游离，但最好是G或C，使PCR产物的末端结合稳定。

6. RT-PCR的结果不好，怎么可以改进一下呢

答：

首先，使用试剂盒进行反转操作失败的可能性有：RNA的纯度和浓度太低，导致反转录失败；其次是没有严格按照说明书的进行操作。

7. PCR反应时，20微升体系中，各组分的量应该怎么确定呢？有无确定标准？

答：

20微升体系指的是这个反应的总体积，只要根据说明书对各组分的量进行添加，都是可以的到理想浓度的cDNA的，如果根据自己的实验情况进行调整，在不明显改变体系的离子浓度下，加1~2微升是可以的，如果说明书写“mg”，那么这个需要调添加cDNA的量。各个成分的量有无确定标准，这可以改变也可以不改变，根据实验所需条件，如果说明书里的条件能跑出来，那没必要改变；跑不出来，我们可以思考一些是不是模板、引物的量是否正确或者退火温度是否合适。