一．protein A的介绍及其与IgG抗体的相互作用机制是什么？

抗体的生产和纯化是通过高度标准化的平台实现的，该平台包括离心、微滤、超滤、protein A亲和层析、病毒灭活、离子交换层析和疏水相互作用层析。protein A亲和层析使用分别从金黄色葡萄球菌或大肠杆菌获得的天然或重组蛋白质配体，与天然或合成的基质偶联。protein A有五个同源结构域（E、D、A、B和C），可以与免疫球蛋白G（IgG）的Fc部分结合。除了mAb，protein A还与具有不同抗原结合特性的不同细胞系产生的多克隆抗体（pAbs）相互作用。

Protein A亲和层析是制药行业中众所周知的工艺，因为它具有高结合亲和力和可获得的纯度水平。纯化工艺包括将含有中性pH下靶抗体的澄清细胞培养物装载在固定化protein A载体上，从而允许配体之间的相互作用。然后，从宿主细胞蛋白（HCP）等杂质中分离蛋白质，并通过降低流动相pH来实现产物解吸。然后，再生树脂并进行原位清洁方案。

Protein A可以共价结合到天然（琼脂糖或纤维素）或合成（聚乙烯醇醚、聚苯乙烯二乙烯基苯、孔玻璃或聚甲基丙烯酸酯）基质。除此之外，protein A技术的另一个障碍是树脂结垢，这是由于非特异性吸附，导致吸附能力降低和树脂寿命缩短。为了应对这种担忧，几项研究试图开发增强型protein A树脂：例如，可以耐受高浓度NaOH（高达0.5M）的固定相，以提高其清洁和消毒效率，并延长其使用寿命。

二．提高protein A纯化的稳定性策略有哪些？

1. 用苏氨酸取代天冬酰胺23残基，导致对0.5M NaOH具有更高的稳定性。这种改进避免了脱酰胺作用，脱酰胺作用会导致蛋白质在碱性pH下不稳定。

2. 用20.7kDa的聚乙二醇（PEG）对配体进行了化学修饰。观察到PEG化后保持了静态结合亲和力。DBC降低是由于PEG化配体的IgG有效孔扩散降低和IgG结合动力学减慢。尽管如此，介质相关污染物的质量还是减少了≥2倍。最后，在聚乙二醇化后的洗脱中观察到IgG的回收率增加了15%。

三．protein A纯化方法的改进方向有哪些？

由于protein A配体不结合所有类型的IgG，并且新的治疗方法如抗体片段可能缺乏Fc区，不同的配体如protein L或protein A和新的亲和配体的组合可能在商业水平上出现，作为mAb分离的下一代。然而，在DBC方面，需要改进替代配体，如肽、Fc结合蛋白和纳米体，以将其视为可行的选择。此外，还需要进一步的研究，以开发新或增强的工艺、固定相和配体，从而超越protein A床色谱法的简单性、产量、可制造性和成本效益。

四．辛酸沉淀法与辛酸-（NH₄）₂SO₄连续沉淀法纯化抗体区别？

在抗体得率方面，辛酸沉淀法与辛酸-（NH₄）₂SO₄连续沉淀法相当，但优于抗体亲和层析法和高效液相色谱法。就抗体的纯度而言，辛酸沉淀法的效率低于其他三种方法。还应注意的是，辛酸沉淀与某些抗体的亲和力降低有关，不适合纯化小鼠IgA和IgG3。

五．HPLC方法纯化抗体的特点是什么？

该方法遇到的主要问题是抗体分子与柱基质的相互作用，导致在明显较低的分子尺寸下观察到峰加宽和洗脱的非理想色谱。在这种条件下，单体从其他物种中的分解受到很大影响。相互作用主要通过两种机制发生，包括疏水力和/或离子力。疏水作用可以通过在流动相中加入少量洗涤剂或有机溶剂来最小化，而离子作用主要通过改变pH或离子强度来控制。由于许多柱支撑材料的弱酸性，碱性疏水性抗体存在主要问题。电荷（基本）离液剂的加入可以帮助最小化这两种类型的力。在这方面，已经发现氨基酸是最合适的（例如赖氨酸和精氨酸）。通常每个样品的分离时间超过30分钟。

基于成熟的抗体平台体系建设，卡梅德生物（KMD Bioscience）能够提供完整的上下游服务，包括从抗原设计，合成与修饰，动物免疫，抗体纯化，噬菌体文库构建与筛选到下游抗体修饰与应用鉴定。同时，我们也提供抗原制备服务，包括DNA合成、质粒构建、蛋白表达、蛋白纯化、多肽合成与修饰、小分子结构分析及与载体蛋白交联等。