1. 什么是纳米抗体

纳米抗体是1993年比利时科学家，在Nature中首次提出并报道。传统抗体分子(IgG)结构由两条相同的重链和轻链组成。抗体分子的轻链包含1个VL区和1个CL区，而重链则拥有1个VH区和3个CH区(CH1、CH2和CH3)。

羊驼只有重链抗体缺少轻链，由4个HC和2个VH组成，其中VHH区域又被称为纳米抗体或单域抗体（single domain antibody, sdAb），纳米抗体（Nanobody, Nb）晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15KDa。纳米抗体主要用于生物医药研发（基因工程药物研发、ADC药物研发）；用于临床体外诊断（胶体金法、酶联免疫吸附法、电化学发光法）；用于肿瘤研究、免疫学等基础研究领域，目前CAR-T治疗型抗体开发受到越来越多科研工作者的关注。

图1：传统的IgG抗体和羊驼纳米抗体结构比较

2. 纳米抗体的优缺点

2.1 纳米抗体的优点

（1）在高温和pH下的稳定性

（2）VHH可以识别通常不被常规抗体识别的抗原位点

（3）它们的小分子片段有助于快速组织渗透和标记应用，包括跨越血脑屏障

（4）用于大规模生产节约成本的替代品

2.2 纳米抗体的缺点

纳米抗体（VHH抗体）由于分子量较小，约为15kDa，相当于传统IgG抗体重链或轻链的可变区，因此针对VHH抗体的二抗不具有普遍适用性，需要将VHH融合Fc片段进行共表达进行解决二抗识别问题（卡梅德生物提供多种抗羊驼二抗，可用于免疫血清效价检测，Cat.#：SPAB01，SPAB03）

3. 纳米抗体（VHH抗体）主要应用方向

基于纳米抗体特殊的结构和性质，在CAR-T治疗型抗体开发领域受到人们青睐。

CAR-T疗法是一种新型的精准靶向治疗肿瘤的疗法，即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。利用基因工程技术手段，将激活的T细胞装上定位导航装置CAR（肿瘤嵌合抗原受体），将T细胞打造成“超级战士”，即CAR-T细胞，利用其“定位导航装置”CAR，能够精准专门识别并消灭体内肿瘤细胞。

4. 卡梅德生物能够为客户提供高质量的驼源纳米抗体开发服务

卡梅德生物可以提供多种驼源纳米抗体开发服务，包括羊驼、大羊驼、骆驼、美洲驼等，基于噬菌体展示技术平台，卡梅德生物可以提供包括抗原设计、羊驼免疫、文库构建与筛选、活性功能验证等主要实验环节，并为全球的科学家提供高特异性和高亲和力的羊驼VHH抗体。

5. 卡梅德生物为客户提供驼源抗体开发的全流程介绍

主要包括以下步骤：羊驼免疫，噬菌体文库构建，抗体库筛选，抗体表达与功能验证。详细流程如下：

图2：驼源纳米抗体开发流程

5.1 羊驼免疫

卡梅德生物提供健康的成年羊驼（28-36月大）进行免疫，约16-20周即可获得高质量的文库和单抗细胞株，交付完整的实验过程记录和免疫动态视频。卡梅德生物根据客户的抗原类型，会制定特定的免疫抗原制备方案以及免疫方案。

5.1.1 抗原准备：客户提供抗原，弗氏佐剂的使用量是1ml，将抗原和佐剂以1:1混合进行免疫。

5.1.2 羊驼免疫：免疫5次，每次间隔20天，在羊驼颈部进行注射，免疫后1小时观察羊驼是否有不适症状。

图3：卡梅德生物工作人员进行羊驼免疫注射

5.1.3 采血：免疫前进行采血，留作阴性对照，在第三、第四次免疫后间隔一星期进行采血5ml效价测定，ELISA检测血清效价，效价满足要求＞10⁵。卡梅德生物为客户提供清晰的免疫时间节点信息表，如表1所示：

表1：卡梅德生物纳米抗体制备免疫时间进程举例

5.1.4 PBMC细胞分离：取外周血100-120mL，PBMC细胞总数为4*10⁷-10⁸个，全部邮寄给客户。

5.2 噬菌体文库构建

卡梅德生物使用M13噬菌体的pIII蛋白进行VHH抗体（纳米抗体）表面展示，制备TG1电转化感受态细胞，构建噬菌体载体，并进行噬菌体库容测定。

5.2.1 RNA提取：按照商业化试剂盒操作进行RNA提取。

图4：RNA抽提电泳图片

5.2.2 CDNA反转录合成：按照商业化试剂盒操作进行cDNA制备。

5.2.3 PCR扩增：以cDNA为模板，PCR扩增重链抗体基因可变区，扩增2轮。

5.2.4 连接载体并电转化：酶切、连接噬菌粒载体，电击转化TG1宿主菌，构建抗体库。

5.2.5 细菌文库/噬菌体文库建立：计算库容量，库容量交付标准10⁸～10⁹。

5.3 抗体库筛选

常规使用的筛选方法是固相筛选，磁珠和细胞筛选（常用于GPCR，离子通道受体的抗体筛选）。

卡梅德生物为客户提供定制化的筛选体系，根据客户的需求不同，我们提供固相筛选，固相/液相筛选以及细胞筛选的方法。前两者适用于蛋白，多肽一类靶抗原的筛选；第三种适用于GPCR，离子通道受体的抗体筛选。通过不同的筛选方法，可以为客户高效的筛选出不同类型的阻断型抗体。

5.4 抗体表达与功能验证

5.4.1 表达：构建哺乳表达体系进行抗体表达，卡梅德建立了完善的哺乳表达体系，包括但不限于FreeStyle 293-F cell line和Expi CHO-S等细胞系，配合卡梅德设计的高表达载体（含有全长的CMV启动子以及优化后的分泌信号肽序列）进行重组抗体表达与制备。

图5：Fc-VHH纳米抗体表达结果图片

5.4.2 纯化：纳米抗体过镍柱纯化。

5.4.3 亲和力测定：将纯化好的纳米抗体进行Biacore亲和力检测。